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QPCR 实验,我忍你很久了!!!

发布时间:2020-07-20 14:49 |  点击次数:


对于常常游走在分子实验室的童鞋们来说,看似简单的「试剂配制——上机——出结果」的 QPCR 检测流程,实则险象迭生,有时一丢丢的差错可能都会让我们怀疑人生。

经常被 QPCR 实验莫名其妙的结果折磨的你,是不是一遍又一遍地探索过原因?

01  试剂准备
QPCR 预混液、引物、探针等常保存在 -20℃ 冰箱,从冰箱取出后溶液常处于部分结晶状态,如果此时带有侥幸心理,用移液器一量,可以吸到所需体积的溶液,就直接拿去配制,那很遗憾,实验多半不会成功。

敲黑板
必须等待溶液完全解冻并涡旋混匀后方可使用,原因是 QPCR 预混液是由多种成分按照一定的浓度及比例混合而成的,在未完全解冻的状态下吸取溶液的成分、浓度都是随机的,那自然实验成功率也是随机的。

02  试剂配制(除模板外)
1)首先我们需要计算出每种成分所需配制样本量的总体积,建议在所需体积的基础上×1.1 或 1.2 倍,以弥补移液过程中的损失,如下(N 为样本总数,包括对照):

2)移液需选择合适量程的移液器,规范移液操作,移液过程中采用质量较好的枪头,以减少吸头中液体挂壁带来的误差。

3)配制好的溶液要求吸打混匀或者涡旋混匀,使溶液充分混合。

4)冰盒或低温金属浴上配制分装,可减少气泡的产生。

 
03  
试剂分装
将混匀后的混合液分装至 QPCR 检测所用的耗材中,常为 PCR 八连排管或 96 孔板。

1)PCR 管
耗材必须选择与 QPCR 仪相匹配的耗材,如 DLAB Accurate 96 推荐使用 0.1mL 标准管或 0.2mL 矮管(Low profile),白管、透明管均可。

  • 实验证明,由于 0.1ml 管比 0.2ml 管高度更低,一方面光程更短,灵敏度更高;另一方面,矮管中反应体系上方的空间相对更小,热传导效率提高,减少了蒸发带来的影响,荧光信号值更稳定。
  • 检测器从顶部扫描,所以白管和透明管均可使用,由于白管可有效阻止荧光折射出管或传递至加热模块,减低背景噪音,效果会更好。
2)管盖/覆膜
采用检测器从顶部扫描的 QPCR 仪,均需选择透明管盖或光学密封膜,高质量的管盖或覆膜也可以提高检测灵敏度及稳定性。

3)分液
为了提高准确性和平行孔之间的重复性,建议初次分液前用待分液试剂润洗枪头,减少误差。

04、加入模板
  1. 加入模板操作需要在独立的样本区进行,防止污染。
  2. 加入模板的体积不能太小,如<2ul,容易放大移液误差,导致平行样本重复性较差,若模板浓度较高,可考虑稀释后再加入。
  3. 加盖或覆膜后必须瞬时离心,防止液体挂壁及气泡影响实验准确性。

05 、上机测试


1)设置样本信息
样本设置信息与检测要求保持一致,按照检测试剂盒说明书设置信息,包括位置,荧光通道,基因名,样本名等;


2)程序设置
扩增曲线延伸阶段(两步法为退火延伸阶段)必须设置荧光采集点「End Point」,否则实验过程不采集荧光,得不到扩增曲线。


TIPS
实验结束后的 PCR 反应液是最大的气溶胶污染源,所以请集中处理,不要在试验区随意开盖哟~

注意以上每个实验操作环节,你就能得到漂亮的曲线啦!